Como funciona a técnica de hibridização genômica comparativa?

Vamos supor uma seguinte situação: O paciente Francisco chega até nós com uma melanoma e, por conta do avanço nos tratamentos, queremos traçar o perfil genético desse câncer. Para isso, podemos lançar mão de vários testes, dentre eles da técnica de hibridização genômica comparativa (CGH, comparative genome hybridization). Com essa técnica, poderemos saber como está a expressão de determinadas proteínas, isto é, se está aumentada ou diminuída em relação aos melanócitos normais de seu Francisco.

Sabemos que determinados genes supressores de tumor, como a p53, podem ter produção suprimida em alguns tipos de cânceres. Já enquanto que alguns proto-oncogenes podem ter sua produção aumentada.

O que fazer então?

Devemos fazer uma biópsia do melanoma e de um fragmento de pele normal de seu João. Colocaremos o material colhido em solução, porém, em frascos diferentes. Em seguida, adicionaremos soluções e faremos procedimentos que desintegrarão as membranas e além disso, irão separar o RNA do restante do material celular (proteínas, membranas, DNA e afins). O RNA será extraído e adicionado a um outro frasco. 

No entanto, precisaremos para esse estudo apenas do RNAm. Como separaremos o RNAm do RNAt e RNAr? Simples! O RNAm possui uma cauda na sua extremidade terminal de poliA, basta, então, passarmos a solução de RNAs por microbolhas que possuem fitas capazes de se parear e, portanto, se ligarem a poliA. Logo, o RNAm se fixará às bolhas, enquanto o restante do RNA será lavado. Após esse procedimento, lavamos a bolha com um outro tipo de solução que se encarregará de soltar o RNAm das bolhas. Assim, pegaremos nosso RNAm purificado em um novo frasco.

Em cada um dos frascos com RNAm, adicionaremos nucleotídeos marcados com fluoróforos e transcriptase reversa. Conseguiremos, então, produzir DNAc. Após isso, separaremos o DNAc do RNAm e estaremos prontos para partir para a técnica do microarray.

Mas pera, o que é microarray?

Microarray é como se fosse uma placa, cheia de furos, em que cada furo você tem uma fita simples de DNA. Há diversos furos e cada furo tem uma sequência específica, normalmente, essas sequências são de genes que se deseja pesquisar. 

Você pegará então o DNAc, simples fita, que você fez anteriormente e colocará nessas placas de microarray. Como é de se esperar, o DNAc de determinados genes irá se parear com o DNA simples fita da placa.

Beleza... E aí?

Acontece que você adicionou fluróforos de cores diferentes para o DNAc da célula cancerígena e da célula normal, certo? Agora você irá fazer uma análise com equipamentos a laser se há alguma super ou hipoexpressão. Como?

É simples... Imaginemos, por exemplo, que você marcou o DNA codificante da célula normal como vermelho e o da célula cancerígena como verde. Agora você vai lá, analisar em seu microarray, a expressão de um proto-oncogene, como o KRAS. Se o seu melanoma tiver superexpressão desse gene, você espera que tenha mais DNA codificante verdes pareados com o DNA da placa microarray do que vermelhos, certo? Então! A análise é feita exatamente dessa forma.

Caso a expressão de KRAS não estivesse alterada na célula cancerígena, veríamos uma cor entre vermelho e verde.

Caso a expressão de KRAS estivesse diminuída na célula cancerígena, veríamos predominantemente a cor vermelha.